Е. В. Вульф.
Способность белковых веществ крови животных образовывать с посторонними данному организму телами противодействующие вещества — серумы и специфичность последних уже давно дала основание для так называемой биологической реакции, позволяющей определить принадлежность исследуемой крови к тому или иному роду организмов. Так, например, для определения принадлежности данного кровяного пятна человеческой крови, поступают следующим образом: берут кролика и впрыскивают ему в кровь несколько раз кровь человека. В крови кролика вырабатываются особые противодействующие вещества специфические только для крови человека. Если через некоторое время после впрыскиваний взять немного крови этого кролика, дав ей свернуться и отделив таким образом ее серум, мы получим реактив для определения человеческой крови.
Для получения реакции растворяют исследуемое кровяное пятно в физиологическом растворе соли и смешивают с полученным серумом. Если образуется осадок, выпадающий под влиянием специфических начал преципитинов, выработавшихся в крови кролика в качестве противодействия человеческой крови, то кровь в исследуемом пятне принадлежит человеку. Если осадка не образуется, то следовательно данные преципитины не могут реагировать на исследуемое вещество и исследуемая кровь принадлежит не человеку.
Эта реакция настолько точна и тонка, что она происходит хотя и менее интенсивно, с кровью биологически родственных организмов. Таким образом удалось, например, показать родственную близость человека и человекообразных обезьян.
В 1906г. Магнус и Фриденталь применили этот метод для определения родственных отношений у растений. Они пользовались выжимками из растений для впрыскивания их в кровь кролика и получения специфического серума. Одним из произведенных ими опытов было докаэано родственное отношение между дрожжевыми грибами и аскомицетами; С этой целью были взяты выжимки дрожжей, трюфеля и шампиньона. Как известно трюфель относится к аскомицетным или сумчатым грибам, шампиньон же к базидиомицетным грибам.
В виду кислотных свойств растительного сока, чтобы предотвратить смерть животного, которому он впрыскивался, его предварительно нейтрализовали содой. Полученные от впрыскивания в кровь кролика серумы при смешении с соками исследуемых растений дали результаты изложенные в следующей табличке:
| Серумы. | Дрожжи. | Трюфель. | Шампиньон. |
| Дрожжей. | Сильное помутнение. | Легкое помутнение. | Отсутствие осадка. |
| Трюфеля. | Отсутствие осадка. | Сильное помутнение. | Отсутствие осадка. |
| Шампиньона. | Отсутствие осадка. | Отсутствие осадка. | Сильное помутнение. |
Этот опыт подтвердил родственные отношения дрожжей с сумчатыми грибами. Отсутствие реакции серума трюфеля с соком дрожжей объясняется необходимостью более продолжительного впрыскивания этого сока в кровь кролика, чем это требуется для сока дрожжей.
Еще раньше в 1901 г. Коварский на основании своих опытов с экстрактами белков из семян пшеницы, овса и гороха, указывал что растительные белки менее различны, чем животные, в виду чего реакция раствора растительного белка на соответствующий серум крови не может иметь такого значения при определении родственных отношений растений, как реакция животных белков.
Эти выводы были сделаны на основании данных, полученных от реакции серума, образовавшегося от впрыскивания в кровь кролика вытяжки из семян пшеницы, при соединении с вытяжками из семян пшеницы, гороха и овса. Причем с первыми двумя реакция получалась, с последним же не имела места. Таким образом, по этим данным пшеница должна находиться в родственных отношениях с горохом и не иметь их с овсом. В 1907 г. те же Магнус и Фриденталь повторили этот опыт и показали ошибочность постановки опыта Коварским.
Этими опытами было с точностью установлена возможность использования биологической реакции для определения родственных отношений растений и использования этого метода для целей филогенетической систематики растений. Применение его давало надежды на возможность проверки существующих систем растительного царства.
И действительно, втечение войны и в последующие годы нашей изоляции от Западной Европы там была начата эта работа рядом исследователей, преимущественно в лаборатории профессора Меца в Кенигсберге. Сводку результатов этих исследований и представляют нижеследующие строки1).
Прежде чем перейти к самим исследованиям необходимо познакомиться с методикой работ, выработанной проф. Мецом.
Белковые вещества тех растений, родственные отношения которых желают установить при помощи биологической реакции, извлекают из семян. Последние могут быть и не свежими, уже утратившими всхожесть. Для извлечения белка семена освобождаются от лишнего балласта — семянной кожуры и пр. и затем измельчаются в фарфоровой ступе в мельчайший порошок, как это применяется в фармацевтической практике. В случае содержания в исследуемых семенах жирных или эфирных масел, они удаляются экстрагированием их спиртом или эфиром, которые одновременно удаляют и алкалоиды, если таковые имелись.
В качестве опытных животных применялись кролики, так как они дают большее количество серума, чем морские свинки и крысы. Иммунизация животных с целью получения серума может быть произведена двояким образом — впрыскиванием непосредственно в вену или же в брюшину.
Подлежащий впрыскиванию растительный порошок растворяется в физиологическом растворе соли или растворе едкого натра и тщательно фнльтрируется до полной прозрачности. После этого раствор, при первом впрыскивании в количестве 2 к. см., впрыскивается в первом случае в вену на ухе кролика, во втором — в брюшину в нижней части живота. При дальнейших впрыскиваниях количество вводимого в кровь кролика раствора доводится, до 10 к. см..
Последующие впрыскивания производятся обычно — второе через 8 дней, последующие три через 5 дней каждое, дальше промежутки могут быть постепенно сокращены до 3 дней. Количество впрыскиваний очень индивидуально и меняется в каждом отдельном случае.
В семенах некоторых растений, как это установлено для Viola tricolor, Camellia japonica, Phytolacca americana и Rhododendron flavum, заключаются ядовитые вещества, неподдающиеся предварительному удалению и вызывающие смерть животных через ½ часа после впрыскиваний. То же самое наблюдалось при употреблении семян содержащих сапонин. Такого рода растения, конечно, должны быть совершенно устранены из опытов.
В виду различного промежутка времени, требуемого для иммунизации от различных растительных белков, а также в зависимости от чисто индивидуальных особенностей животного, производится пробное извлечение крови.
В случае благоприятных предварительных результатов, животное убивается и из него извлекается вся кровь. Последнее может быть произведено двумя способами: при первом из них животное в живом состоянии неподвижно укрепляется при помощи особого прибора, после чего ему разрезают кожу на шее, отгибают ее в стороны и при помощи пинцетов раздвигают шейные мускулы настолько насколько это необходимо, чтобы обнажить сонную артерию. После чего последняя перерезается, а вытекающая в большом количестве кровь собирается до полного истощения и смерти животного.
При этом способе теряется много крови, остающейся во внутренних органах животного, и кроме того он сопряжен с сильными страданиями животных, вследствие чего чаще применяется второй способ. Он заключается в том, что животное очень сильно хлороформируется и закрепляется на спине, как и в первом случае. После этого ему разрезают грудь, вскрывая таким образом грудную полость, и перерезают непосредственно над сердцем аорту. Вытекающая кровь скопляется в грудной полости, откуда ее извлекают при помощи пипеток. После свертывания крови, серум отделяется от нее путем центрофугирования.
Получение реакции может быть достигнуто двумя методами: 1) к серуму добавляют, в количестве особо определяемом, раствор исследуемого белка в физиологическом растворе соли. В случав наличия родственных отношений происходит выпадение осадка — преципитпна. 2) Другой метод, требующий значительно меньшего количества серума, заключается в том, что через 2 часа после смешения серума с раствором белка к смеси добавляют 0,4 к. см. серума бычачей крови. В случае наличия родственных отношений происходит конглютинация.
Результаты реакции выражаются табличкой, аналогично нижеследуемому примеру.
| Экстракт из семян. | 0,1 к. см. иммун. серума + экстракта. | 0,1 к. см. нейтр. серума + экстракт. |
|||||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | 1:6400 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | |
| Reseda grandiflora | сильн. реак. | средн. реак. | средн. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | — | — | — |
| Cleome candelabrum | слаб. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | — | — | — | — | — |
| Cheiranthus Cheiri | средн. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | слаб. реак. | — | — | — | — | — |
| Akebia quinata | — | — | — | — | — | — | — | — | — |
Из введенных в круг исследований растений род Cleome относится к сем. Сарparidaceae, p. Cheiranthus к сем. Cruciferae, находящихся в родственных отношениях к сем. Resedaceae. Род же Akebia принадлежит к сем. Larzibalaceae, родственных отношений с последним не имеющим.
При всех реакциях ставилось в необходимое условие обратимость реакции, т. е. если серум данного вида образовывал преципитины с представителями семейства, родственные отношения которого желательно определить, причем промежуточные звенья указывали на те же родственные отношения, то и в обратном порядке серум полученный с видом последнего семейства должен дать те же самые реакции.
Возникало еще сомнение не может ли на какой-либо фазе исследования в химизме белковых веществ встретиться явление конвергенции. Возможность таких конвергенций была бы несомненной, если бы в построенном на основании таких реакций родословном дереве крайние звенья, чрезвычайно удаленные друг от друга, дали бы безукоризненную реакцию.
Если бы такой случай хоть раз имел бы место то все построения, основанные на этом методе, потеряли бы всякое значение. Но до сих пор при нескольких сотнях тысяч произведенных реакций ни разу не было и намека на возможность таких конвергенций.
Обратимся теперь к самим исследованиям и начнем с голосемянных растений, исследованных Кирштейном.
В качестве примера одну из серий опытов можно примерно изобразить следующей табличкой.
| С экстрактом. | Реакция. | Начало реакции при растворе 0,08 через |
| Abies Nordmanniana | сильная | 20' |
| Pinus silcestris и др. | ||
| Abieteae | ||
| Libocedrus decurrens | Постепенно слабеющая |
40' |
| Callitris quadrivalvis | ||
| Biota orientalis | ||
| Junipetus communis | 60' | |
| Gephalotaxus Fortunei | ||
| Taxus baccata | 90' | |
| Ephedra altissima | ||
| Podocarpus Mannii | 120' | |
| Torreya nucifera | 150' | |
| Sclaginella caulescens | ||
| Araucaria imbricata | — | — |
| Araucaria brasiliana | — | — |
| Gycas revoluta | — | — |
| Encephalartos villosa | — | — |
| Magnolia purpurea | заметная | 90' |
| сильная | 120' | |
| Magnolia hypoleuca | заметная | 120' |
| Magnolia tripetala |
Аналогичные реакции были сделаны с серумом Picea excelsa, Pinus silvestris, Taxus baccata, Ginkgo biloba и Cycas revoluta. Эти реакции дали ряд указаний для построения системы голосемянных и их присоединения с одной стороны к более низко стоящим папоротникообразным, с другой — к покрытосемянным. Они могут быть сведены к следующему:
1) Однородность реакций, полученных с экстрактами видов разных родов Abietineae, указала на естественность этого семейства и на древнооть входящих в него родов.
2) Наибольший интерес представляет положительная реакция с родом Selaginella, относящимся к разноспоровым плауновым и отрицательная с цикадовыми. Эти реакции указывают на необходимость выведения хвойных из плауновых — конечно, не непосредственно из p. Selaginella, а из исходных ископаемых форм, возможно близких к лепидодендровым.
Эти неожиданные данныя интересны еще и в том отношении, что могут иметь значение при разрешении очень давнего морфологического спора относительно понимания строения шишки хвойных, как цветка или соцветия. Этому спору, начавшемуся еще с Линнея, посвящена целая литература, насчитывающая до 115 названий. Все это многообразие взглядов мы можем все же свести к двум главным точкам зрения:
1) Теория Сакса-Эйхлера — плодовая чешуя представляет из себя выросты в виде плаценты или лигулы на открытом плодолистике, каковым является покровная чешуя. Следовательно, вся шишка является цветком.
2) Теория А. Брауна-Челяковского — в пазухе измененного листа — покровной чешуи, расположен укороченный побег, два листа которого сросшись образовывают плодовую чешую. На этом укороченном побеге располагаются плодолистики, редуцированные до одной семяпочки каждый. Вся шишка будет следовательно соцветием.
Найденные родственные отношения с плауновыми, для которых наличие лигулы является характерным признаком, укрепляет теорию Сакса-Эйхлера. Но если рассматривать шишку хвойных как цветок, то связь голосемянных с покрытосемянными нужно будет искать в магнолиевых. Реакции Кирштейна, указывающие так настоятельно на родственные отношения Abietineae и Magnoliaceae, возможно дают экспериментальное обоснование этой последней точки зрения. Тогда мы должны будем принять, что шишка хвойных представляет из себя продукт дальнейшего развития лепидодендровых, а цветок магнолиевых ее позднейшее производное.
Можно отметить еще полное отсутствие положительных реакций с араукариевыми, стоящими таким образом совсем особняком, и положение Ginkgo, которого, по толкованию реакций Кирштейном, следует считать не исходной формой, а более поздней производной Taxaceae — положение пожалуй более всего другого в системе Кирштейна, требующее доказательства и проверки.
Проверка родственных отношений у однодольных была выполнена Ворсеком, причем полученные им результаты могут быть сведены к следующим двум положениям:
1) Подтверждается отхождение однодольных от двудольных несколько выше магнолиевых (см. схему 1).
2) С несомненностью вытекает из реакций, что Helobiae являются филлогенетическим базисом однодольных, из которого развились все остальные, относящиеся к ним семейства (детали см. в схеме 2).
По исследованиям Маллигсона "ветвь Centrospermae" должна включать, помимо самих Centrospermae еще почти все главнейшие однопокровные — Monochlamydeae. В исследованиях Маллигсона интересно отметить обнаруженную им родственную связь Centrospermae с примуловыми. Здесь впервые опытным путем доказывается искусственность группы спайнолепестных.
Родственная связь сережкоцветных с Gymnospermae не подтвердилась и тем самым должна отпасть и возможность выведения покрытосемянных через однопокровных из голосемянных, как это принимается некоторыми ботаниками. Эти данныя тем более интересны, что в этом случае реакции делались, так сказать, в слепую — исследователь получил порошок для реакции, не зная к какому растению он относится.
Интересны реакции произведенные Гёфгеном с рядом Columniferae. По Веттшейну, последний выводился из ряда Tricoccae, цветок, главных представителей которого — молочайных принимался ими за примитивный, а не вторично упрощенный.
Реакции же показали как раз обратные взаимоотношения: на их основании молочайные должны быть расположены не в основании Columniferae, а в их вершине и, следовательно, цветок молочайных должен быть рассматриваем не как примитивный, а вторично-упрощенный.
Серо-диагностическая обработка спайнолепестных, необходимость выделения из которых Primulales (а также и Ericales), была показана раньше, была произведена Алекснатом и дала следующие результаты:
Серум семейства огуречных давал сильные реакции, как вниз по системе до Раrietales, так и вверх до конечных разветвлений спайнолепестных. Таким образом, огуречные представляют точку отхождения семейств последних от основного ствола системы. Из огуречных же через сем. Oleaсеае должна быть выведена "ветвь" Tubiflorae, представляющая по белковым реакциям вполне замкнутую группу форм.
Непосредственным продолжением Cucurbitaceae и вместе с тем конечными звеньями системы являются колокольчиковые и сложноцветные, давшие отрицательные реакции с группой Tubiflorae.
Изолированную ветвь спайнолепестных образуют еще Ebenales-Styracaceae.
Все до настоящего времени полученные результаты этой коллективной работы сведены проф. Мецом в приводимую здесь схему (1).
Несмотря на всю заманчивость полученных результатов, еще преждевременно увлекаться этим новым методом определения родственных отношений растений. Необходимо установить его точнооть, исключить всякую возможность случайных совпадений, усовершенствовать самую методику работы.
Но, если после тщательной проверки рядом других исследователей и в других лабораториях полученных реакций, данныя их подтвердятся, то мы получим уверенность в возможности применения этого экспериментального метода для целей филлогенетической систематики растений.
Ботанический Кабинет
Крымского Университета.
Ноябрь 1923.
1) См. Botanisches Archiv, В. I, II. 1922.
